ارزیابی میزان تولید داروی دسفرال از سویه استرپتومایسس پیلوسوس به روش بیولوژیک

عنوان کامل: ارزیابی میزان تولید داروی دسفرال از سویه استرپتومایسس پیلوسوس به روش بیولوژیک

تعداد صفحات: 174

دسته: پزشکی، داروسازی، شیمی

---

مقدمه            

چه قدر زیبا و شاعرانه است که انسان به نوای دلنواز عاشقانه ای که در دل موجودات زنده نواخته می شود گوش دهد. تمام پدیده های هستی که زائیده اراده و مشیت الهی هستند منظر شناخت خداوند قادرند و چه با شکوه است علمی که انسان طالب معرفت را به سرچشمه شناخت این پدیده ها راهنمایی کند.

چشم دل بازکن که جان بینی                                                آنچه نادیدنی است آن بینی

امروزه عرصه ای از حیات بشری را نمی توان یافت که تأثیر مثبت از بیوتکنولوژی نداشته باشد. کلمه بیوتکنولوژی که از دو بخش بیو (به معنی زندگی و موجودات زنده) و تکنولوژی (به معنای هنر بشر در استفاده از علم) تشکیل شده است  بطور کلی بیوتکنولوژی به مفهوم استفاده از موجودات زنده، اندام ها و سلولهای آنها برای تولید یک فرآورده با خدمات با ارزش اقتصادی به منظور بهبودرفاه بشر می باشد. بعبارت دیگر بیوتکنولوژی دانشی است که در رابطه با استفاده از موجودات و متابولیتهای آنها جهت تولید فرآورده های مختلف دارویی، غذایی، شیمیایی و غیره در مقیاس صنعتی بحث می کند.

سرآغاز بیوتکنولوژی به ده هزار سال پیش برمی گردد. روند تکاملی بیوتکنولوژی در طی هزاران سال شکل گرفته است، ولی بیوتکنولوژی مدرن در اواسط دهه 70 متولد شد. از همان آغاز، بیوتکنولوژی در قالب مهندسی شیمی توسعه یافت، از این رو با توسعه فرآیندهای صنعتی، گستردگی بیشتری پیدا کرد. بیوتکنولوژی از تکنیکهای مختلف ژنتیک، میکروبیولوژی کاربردی، شیمی، بیو شیمی، بیو لوژی، مهندسی فرآیند و غیره تشکیل می شود.

ابزار توانمند بیوتکنولوژی در پزشکی، کشاورزی، حفاظت از محیط زیست انقلاب عظیمی را بوجود آورد و امیدی برای حل بسیاری از مشکلات حاد بشر در سده بیست و یکم است.

بیوتکنولوژی علمی است که بهترین راه برای یافتن علت بیماری ها و درمان آنها مورد استفاده قرار می گیرد بطوری که در زمینه بهداشت تحولی عظیم ایجاد کرده است. انتقال وبیان ژنهای موجودات زنده و نوترکیبی آنها در آزمایشگاه به تولید محصولاتی که در پیشگیری و تشخیص و درمان بیماری ها کاربرد دارند از مهمترین عرصه های بکارگیری این دانش در توسعه ارتقاء سلامت و بهداشت جامعه و کنترل بیماری های عفونی و غیر عفونی می باشد. تشخیص دقیق و سریعتر بیماریها از جمله ناهنجاریهای ژنتیک و غربالگری از آنها، تشخیص پیش از تولد، استفاده از سلولهای بنیادین و سلولهای پایه و جنینی در مطالعات پایه و کاربردی پزشکی، تولید داروهای نوترکیب، تشخیص هویت، xenotransplantation  با استفاده از حیوانات برای تولید بافت و اندام های مورد نیاز انسان، ژن درمانی و درمان بسیاری از بیماریهای صعب العلاج و تولید پروبیوتیک ها، بهبود کیفیت مواد غذایی و از همه مهم تر درک فرآیندهای زیستی عوامل بیماری زا، مکانیزم عمل آنها و تدبیر راهبردهای جدید بهداشت و درمان، تنها تعدادی از کارهای بیوتکنولوژی در عرصه بهداشت و پزشکی است.   

چکیده 
دسفری اکسامینB، تنها سیدروفوری است که فرم مزتیله آن (نمک متان سولفونات دسفری اکسامین B) با نام تجاری دسفرال جهت درمان بیماران تالاسمی، به منظور شلاته کردن بار اضافی آهن، استفاده می گردد.
به همین منظور جهت تولید دسفری اکسامین B، از سویه استرپتومایسس پیلوسوس استفاده گردید و سویه مربوطه در محیط کشت Soy bean کشت داده شد و دسفری اکسامین آن بوسیله استفاده از محلول فنل- کلروفرم و اتر استخراج گردید. به منظور طراحی این سیستم بیولوژیکی و افزایش بهره برداری از محصول مذکور از منابع کربن و نیتروژن مختلف استفاده گردید و تاثیر هر یک بر میزان دسفری اکسامین تولیدی بررسی شد. چنانچه مشاهده گردید که اسید آمینه ترئونین، افزایش قابل ملاحظه ای بر دسفری اکسامین تولیدی از سویه مذکور دارد و مقدار %125/0 ترئونین، در محیط کشت Soy bean، بسیار مطلوب می باشد. از طرفی اثر ویتامین تیامین (B1) بررسی گردید و مشاهده شد که تاثیر مثبت بر دسفر اکسامین تولیدی دارد و در رده بعد از اسید آمینه ترئونین قرار می گیرد. همچنین اثر اسید آمینه لوسین نیز بر تولید دسفری اکسامین مثبت بوده و در رده بعد از ویتامین تیامین (B1) قرار می گیرد.
در این تحقیق از شلاته کننده های کاتیونی EDTA، 8-hydroxyquinoline  در محیط کشت Soy bean استفاده شد و مشاهده گردید که شلاته کننده های مذکور اثر منفی بر تولید دسفری اکسامین  دارند در نتیجه، کاتیونها، اثر مثبت بر افزایش میزان دسفری اکسامین تولیدی خواهند داشت به همین منظور مواد معدنی مختلف از جمله اثر
CaCl2. 2H2O,MgSO4. 7H2O,ZnSO4. 7H2O, MnCl2, FeSO4. 7H2O
و همچنین  اثرCaCl2. 2H2O,MgSO4. 7H2O به طور همزمان در محیط کشت Soy bean بررسی گردید.
در این تحقیق نتایج مطلوبی بدست آمد، بطوری که کلسیم (بصورت CaCl2. 2H2O) اثر قابل ملاحظه ای بر افزایش میزان دسفری اکسامین تولیدی از سویه مذکور دارد و مقدار  8/2، و  2، CaCl2. 2H2O سبب افزایش قابل توجهی بر میزان محصول مذکور می گردد. و بدین ترتیب تاثیر مثبت کلسیم، بر تولید دسفری اکسامین مشخص گردید.
در این آزمایشات تاثیر مثبت روی، منیزیم و منگنز بر دسفری اکسامین تولیدی آشکار گردید بطوری که غلظت   2-10 × 4/0، ZnSO4. 7H2O و   6/0، MgSO4. 7H2O و   2، MnCl2 سبب افزایش تولید دسفری اکسامین شد.
از طرفی استفاده همزمان CaCl2. 2H2O,MgSO4. 7H2O در محیط کشت Soy bean اثر منفی بر تولید دسفری اکسامین را نشان داد.
همچنین بررسی ها در مورد آهن (بصورت FeSO4. 7H2O) نشان داد که افزایش غلظت آهن، سبب کاهش میزان دسفری اکسامین تولیدی گردید.
و اینگونه با استفاده از منابع نیتروژن و مواد معدنی مختلف بهینه سازی محیط کشت انجام گرفت و تولید دسفری اکسامین از سویه استرپتومایسس پیلوسوس به میزان قابل ملاحظه ای افزایش یافت.
در این تحقیق، پروتئاز تولیدی از سویه استرپتومایسس پیلوسوس نیز بوسیله روش لوری (Lowry) اندازه گیری شد و اثر روی بصورت ZnSO4. 7H2Oو آهن بصورت FeSO4. 7H2O نیز بررسی گردید و مشاهده شد که افزایش غلظت روی، سبب افزایش پروتئاز تولیدی، از سویه مذکور گردید. 

 فهرست

چکیده 1
مقدمه 3

 فصل اول
1-1 - تالاسمی 8
1-2-اتیولوژی و سبب شناسی تالاسمی 8
1-2-1 - خون شناسی 9
1-2-2- خون سازی و گلبولهای قرمز 10
1-3- تالاسمی و انواع آن 10
1-3-1 آلفا تالاسمی 10
1-3-2- بتا تالاسمی 11
1-3-2-1 بتا تالاسمی مینور (سالم ناقل) 11
1-3-2-2 – بتا تالاسمی ماژور (بیماری تالاسمی) 12
1-3-2-3-بتا تالاسمی بینابینی 13
1-4- تشخیص تالاسمی 13
1-5- درمان تالاسمی 13
1-6- فیزیولوژی عنصر آهن و اهمیت آن در بدن انسان 14
1-6-1- مسمومیت حاد آهنی 15
1-7- دسفرال 16
1-7-1- نحوه استفاده از داروی دسفرال 17
1-7-2-کاربردهای داروی دسفرال در پزشکی 18
1-7-3- عوارض ناشی از داروی دسفرال 19
1-7-4- اقدامات احتیاطی در مورد داروی دسفرال 19
1-7-5- ملاک توقف درمان بوسیله دسفرال 20

فصل دوم
2-1-  سیدرو فورها 22
2-1-1- هیدروکسامات ها 24
2-1-2-فنولات ها یا کاتکولات ها 25
2-2- دسفری اکسامین ها 26
2- 2-1 – ساختمان دسفری اکسامین 28
2-2-2- دسفراکسامین بصورت آنتی اکسیدان 28
2-2-3 – خصوصیات فیزیکو و شیمیایی دسفراکسامین 29
2-2-4- مکانیسم دسفراکسامین در جلوگیری از بیماریهای با بار اضافی آهن 29
2-2-5- تشکیل رادیکال  DFO nitroxide 30
2-3-  دسفری اکسامین B 31
2-3-1- بیوسنتر دسفری اکسامین B 33
2-3-2- ژنهای کد کننده دسفری اکسامین B 33
2-4- تولید کننده¬های دسفری اکسامین 34
2-5- اهمیت آهن بر روی میکروارگانیسمها 35
2-6- مکانیسم عمل سیدروفورها در ارتباط با انتقال آهن به درون سلول میکروارگانیسمها 36
2-7- تولید، استخراج و تخلیص دسفری اکسامین B 37

فصل سوم
3-1- اکتینومیست ها 40
3-2- استرپتومایسس ها 43
3-2-1- پاتولوژی 43
3-2-2 – مرفولوژی و ساختمان 43
3-2-3- مشخصات کلنی 454
3-2-4- اسپورزایی 47
3-2-5- ترکیبات پوشش سلولی 49
3-2-6- تغذیه و فاکتورهای موثر بر رشد و خصوصیات فیزیکوشیمیایی 49
3-2-6-1- تغذیه 49
3-2-6-2- اکسیژن 50
3-2-6-3 - رطوبت 50
3-2-6-4- دما 51
3-2-6-5- pH 51
3-2-6-6- اکولوژی 52
3-2-6-7- بیولوژی توسعه یافته استرپتومایسس 53
3-2-7- انواع فرآورده های میکروبی 56
3-2-7-1- متابولیت های اولیه 56
3-2-7-2- متابولیت های ثانویه 56
3-2-7-2-1- آنتی بیوتیک ها 58
3-2-7-2-1-1- فیزیولوژی و تنظیم تولید آنتی بیوتیک 58
3-2-7-3- آنزیمها 63
3-2-7-3-1- پروتئازها 63
3-2-7-3-1-1- پروتئازهای اسیدی 67
3-2-7-3-1-1-1- رنین 67
3-2-7-3-1-2- پروتئازهای خنثی 67
3-2-7-3-1-3- پروتئاز های قلیایی 67
3-2-7-3-1-3-1- فرآیند تخمیر پروتئازهای قلیایی 68
3-2-7-3-1-3-2- تعیین فعالیت پروتئاز قلیایی 69
3-2-7-3-1-4- بازدارنده های فعالیت آنزیم پروتئاز وشلاته کننده ها 69
3-2-7-3-1-5- تجزیه 71
3-2-7-3-1-6- پروتئاز ها و استرپتومایسسها 71
3-2-8- محیط کشت  تخمیر صنعتی 71
3-2-8-1- نیازهای غذایی میکروارگانیسم ها 71
3-2-8-1-1- کربن 74
3-2-8-1-1-1- منابع کربن و استرپتومایسس ها 77
3-2-8-1-2-نیتروژن 78
3-2-8-1-2-1-  منابع نیتروژن و استرپتومایسس ها 80
3-2-8-1-3- هیدروژن و اکسیژن 80
3-2-8-1-4- مواد معدنی 80
3-2-8-2-تنظیم کننده های متابولیکی 81
3-2-8-3- ضد کف ها 82
3-2-9- بیوسنتز  در استرپتومایسس ها 83

فصل چهارم
4-1- دستگاه های مورد استفاده 86
4-2- وسایل مورد استفاده 86
4-3 - محیط های کشت مایع برای رشد باکتری 88
4-4- محیط های کشت جامد برای رشد باکتری 89
4-5- محیط های جامد برای تولید اسپور 89
4-6- مواد لازم جهت رنگ آمیزی گرم 90
4-7- مواد لازم جهت استفاده از میکروسکوپ نوری 91
4-8- محیط مورد استفاده جهت شناسایی کیفی دسفری اکسامین: محیط Des4 91
4-9- محیط مورد استفاده جهت اندازه گیری تولید دسفری اکسامین محیط Soy bean  91
4-10- مواد لازم جهت نگهداری و ذخیره باکتری ها 92
4-11- معرف های دسفری اکسامین 92
4-12- مواد لازم جهت رسم منحنی استاندارد دسفری اکسامین B 92
4-13- مواد لازم جهت استخراج دسفری اکسامین 92
4-14- مواد لازم جهت تهیه محلول Lysing Buffer 93
4-14-1 – مواد لازم جهت تهیه محلول Tris Hcl 93
4-15- محلول کازئین %5/0 دربافر فسفات 93
4-15-1- بافر فسفات (PBS) 93
4-16- محلول لوری (Lowry) 93

فصل پنجم
5 – 1- تهیه و آماده سازی سویه استرپتومایسس پیلوسوس 98
5 2 بررسی خصوصیات مرفولوژیکی سویه استرپتومایسس پیلوسوس 98
5-2-1- خصوصیات ماکروسکوپی 99
5- 2-1-1- کشت استرپتومایسس پیلوسوس بر روی محیط جامد 99
5-2-1-2- کشت استرپتومایسس پیلوسوس در محیط مایع 99
5-2-2 خصوصیات میکروسکوپی 99
5-2-2-1- تهیه لام از محیط کشت جامد 99
5-2-2-2- تهیه لام از محیط کشت مایع 100
5 22 3 رنگ آمیزی گرم 100
5 3 تهیه مایع تلقیح 100
5 3 1 تهیه محیط ذخیره 101
5 3 2 تهیه سوسپانسیون اسپور 101
5 4 رسم منحنی رشد استرپتومایسس پیلوسوس 101
5 5 بررسی تغییرات  pH در محیط کشت Soybean 102
5 6 تولید دسفری اکسامین توسط استرپتومایسس پیلوسوس 102
5 6 1 تشخیص کیفی دسفری اکسامین 102
5 6 2 سنجش میزان تولید دسفری اکسامین در هر روز 103
5-6-3- رسم منحنی استاندارد دسفرال 103
5-7 استخراج دسفری اکسامین بوسیله فنل-کلروفرم 104
 5 7 1 مزتیله کردن دسفری اکسامین 105
5-8- تعیین وجود دسفری اکسامین B در ماده استخراج شده 105
5 9  بهینه سازی محیط کشت تولید دسفری اکسامین 107
5 9 1 بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین 107
5 9 1 1 بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین در یک محدوده غلظت 107
5 9 2 بررسی اثر اسیدآمینه ترئونین و اسید آمینه لوسین و ویتامین تیامینB1)   (برتولید دسفری اکسامین  108
5 9 3 بررسی گلوکز و ملاس و سوکروز بر تولید دسفری اکسامین 108
5 9 4 بررسی اثر شلاته کننده های کاتیون بر تولید دسفری اکسامین 108
5 9 5  استفاده از محیط کشت عصاره مخمر به جای استفاده از محیط کشت Soybean 109
5 9 6 بررسی اثر مواد معدنی مختلف بر میزان تولید دسفری اکسامین 109
5 961 بررسی تاثیر مواد معدنی در غلظت های مختلف بر میزان تولید دسفری اکسامین 111
5 10 - بررسی پروتئاز تولیدی از استرپتومایسس پیلوسوس در حضور شلاته  کننده ها و مواد معدنی مختلف 112
5 10 1 کشت باکتری و سنجش پروتئاز 112
5 10 2 تخلیص کازئین 113

فصل ششم
6 1 بررسی خصوصیات مرفولوژیکی ماکروسکوپی استرپتومایسس پیلوسوس 115
6 1 1¬ خصوصیات ماکروسکوپی سویه استاندارد بر روی محیط کشت جامد 115
6 12 خصوصیات ماکروسکوپی سویه استاندارد در محیط کشت مایع 115
6 2 بررسی خصوصیات مرفولوژیکی میکروسکوپی استرپتومایسس پیلوسوس 116
6 3 رسم منحنی رشد استرپتوماسیس پیلوسوس در محیط کشت MYB 116
6-4- رسم منحنی pH بر حسب زمان در محیط کشت Soybean حاوی سویه استرپتومایسس پیلوسس 118
6 5 تشخیص کیفی و کمی دسفری اکسامین تولیدی 120
6-5-1- تشخیص کیفی و تولید و یا عدم تولید دسفری اکسامین 120
652 رسم نمودار استاندارد دسفرال 120
653 میزان دسفری اکسامین تولیدی در هر روز توسط سویه استرپتومایسس پیلوسوس در محیط Soy bean 121
6-6- نتایج مربوط به استخراج دسفری اکسامین تولید شده توسط سویه استرپتومایسس پیلوسوس 122
6-6-1- نتایج مربوط به تأیید وجود دسفری اکسامین B در ماده استخراج شده 122
6-7-  بهینه سازی محیط کشت تولید دسفری اکسامین 124
6-7-1  بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین 124
6-7-1-1- بررسی اثر اسید آمینه ترئونین بر تولید دسفری اکسامین در یک محدوده غلظت 124
67 2 بررسی اثر اسید آمینه های ترئونین و لوسین و ویتامین تیامین (B1) 126
6 73 بررسی گلوکز، ملاس، سوکروز بر تولید دسفری اکسامین 126
6 7 4 بررسی اثر شلاته کننده های کاتیون بر میزان تولید دسفری اکسامین 127
6 7 5 استفاده از محیط کشت عصاره مخمر به جای استفاده از محیط کشت Soybean 128
6 7 6 بررسی اثر مواد معدنی مختلف بر میزان تولید دسفری اکسامین 128
6 – 7 – 6 – 1 – بررسی اثر مواد مختلف با غلظت متفاوت بر میزان تولید دسفری اکسامین  130
68 بررسی پروتئاز تولیدی از استرپتومایسس پیلوسوس در حضور شلاته کننده و مواد معدنی مختلف 139

فصل هفتم
- بحث و نتیجه گیری 143
- پیشنهادات 147
- فهرست منابع 149

جهت دانلود محصول اینجا کلیک نمایید